植物中酰脲含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4375

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、提取液A液：自備無水乙醇；

2、試劑五：臨用前取1瓶加入2 mL蒸餾水溶解備用，可分裝后-20℃保存，-20℃保存一周；

3、試劑六：自備濃鹽酸；

4、標準品：10 mg尿*素。臨用前加入632.5 μL蒸餾水配制成100 μmol/mL酰脲標準液。

產品說明：

選育高固氮活性豆科植物品種是提高豆科植物固氮能力的一個有效途徑。大豆根瘤菌固氮的最初輸出產物主要是酰脲（尿*素和尿囊酸）。酰脲是大豆一根瘤菌共生固氮中的氮代謝產物，是氮素貯藏和運輸的主要形式，在大豆氮代謝中起著重要作用。可通過測定豆科植物組織中酰脲的含量，從而評估其固氮能力。

尿*素在過酸或堿條件下水解產生乙醛酸，然后在苯 肼和強酸條件下可被氧化，生成紅色絡合物，在535 nm處有特殊吸收峰，據此可由吸光值計算出樣本中酰脲的含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、鼓風烘箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽、30~50目篩、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

植物樣本：將供試的植物樣本在65℃的鼓風烘箱中烘干，研磨成粉狀，過30~50目篩。按質量（g）︰提取液體積（mL）1︰10~20比例（建議稱取0.1 g烘干樣本，依次加入1.0 mL提取液A與1.0 mL提取液B，禁止將提取液A與提取液B混勻待用），漩渦混勻，在80℃水浴鍋中萃取5 min，然后3500 rpm，室溫，離心15 min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至535 nm，蒸餾水調零。

2、 將試劑六與試劑七置于冰水浴中預冷30 min以上，并置于冰上待用。

3、 標準液的處理：將標準品配制成100 μmol/mL的標準液后，用蒸餾水稀釋至25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 nmol/mL的標準溶液備用。

4、 操作表：（在1.5mL EP管中操作）

注意：對照管不進行水浴加熱處理；尿囊酸測定管只需進行第二次的沸水浴；測定管、標準管及空白管在沸水浴加熱時，EP管蓋緊并用封口膜密封，避免液體蒸發影響試驗數據。

三、植物中酰脲含量計算

1、 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA尿囊酸和ΔA酰脲分別帶入方程得到x₁（nmol/mL）和x₂（nmol/mL）。

2、 豆科植物中酰脲含量的計算：

尿囊酸含量（nmol/g 質量）= x₁×V提取÷W==2×x₁÷W

酰脲含量（nmol/g 質量）= x₂×V提取÷W=2×x₂÷W

V提取：加入提取液體積，2 mL；W：樣本質量，g。

注意事項：

1、同一批檢測樣本需配1-2個空白管。

2、當OD值高于1.5時，建議將樣本稀釋后檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

3、試劑六與試劑七在使用之前請先置于冰上預冷30 min以上。

實驗實例：

1、取0.1g馬齒莧，進行樣本處理，按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA酰脲=A酰脲測定管-A對照管=0.332-0.226=0.106，帶入標準曲線y=0.0548x-0.024，計算x2=2.3723，按照計算公式計算：

酰脲含量（nmol/g 質量）=2×x₂÷W=2×2.3723÷0.1=47.446 nmol/g 質量。

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