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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC2270-50T/48S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1548
010-50973130
產品分類
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果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶（FBA）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC2270
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
| 提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 提取液二 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑一 | 液體25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
| 試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑四 | 液體20 μL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑五 | 液體200 μL×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
試劑二：臨用前加入5 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑三：臨用前加入5 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑四：液體置于試劑瓶內EP管中。臨用前加入5 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑五：液體置于試劑瓶內EP管中。臨用前加入5 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
產品說明：
果糖1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FBA）（EC4.1.2.13）是糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑及光合作用中參與calvin循環的重要酶，催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解為磷酸二羥丙 酮和3-磷酸甘油醛，廣泛存在于動植物及微生物體內，在各種逆境脅迫下表現不同的響應。
果糖1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙 酮，在磷酸丙糖異構酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙 酮生成NAD和α-磷酸甘油，340nm處吸光值的變化可反映果糖1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、分析天平、低溫離心機、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、漩渦震蕩儀、超聲破碎儀、冰。
操作步驟：
樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
①總FBA酶：
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）充分冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
細菌或細胞：按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細菌或細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
液體：直接檢測。
②胞漿和葉綠體FBA酶的分離：
按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5-10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），手工快速研磨或勻漿，之后于4℃，200g離心5min；
棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min（離心時緩慢加速和降速）；
取上清用于測定胞漿FBA酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，上清即為葉綠體中FBA酶活性。
建議測定總FBA酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的FBA，則按照步驟②提取粗酶液。
二、測定步驟
分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
樣本測定：(在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑)
| 測定管 | 空白管 | |
| 試劑一（µL） | 500 | 500 |
| 試劑二（µL） | 100 | 100 |
| 試劑三（µL） | 100 | 100 |
| 試劑四（µL） | 100 | 100 |
| 試劑五（µL） | 100 | 100 |
| 樣本（µL） | 100 | - |
| 蒸餾水（µL） | - | 100 |
| 充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴5min，拿出迅速擦干測定310s時的吸光值A2，分別記為A1測定、A2測定、A1空白和A2空白，計算ΔA測定管=A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次） | ||
注意：如果檢測樣本量大，可以將試劑一、二、三、四、五按照5:1:1:1:1（V:V:V:V:V）的比例配成工作液待用（現配現用）。
三、FBA酶活計算
按蛋白濃度計算
酶活單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
FBA酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
按樣本質量計算
酶活單位定義：每g組織每分消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
FBA酶活（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W
按照細胞或細菌數量計算
酶活單位定義：每104個細胞或細菌每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
FBA酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷細胞數量（萬個）
（4）按液體體積計算
酶活單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
FBA酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA
V反總：反應體系總體積，0.001L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；109：單位換算系數，1mol=109nmol。
注意事項：
若ΔA大于0.8建議將樣本用相應提取液進行適當的稀釋再進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
若是植物樣本，建議在提取完成后2h內檢測完，如果樣本量過大，建議分批提取、檢測。
由于提取液一中含有一定濃度的蛋白（約0.5mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度是需要減去提取液本身的蛋白含量。
實驗實例：
取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清稀釋8倍后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.257-1.06=0.197，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.164-1.16=0.004，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.197-0.004=0.193，按樣本質量計算酶活：FBA酶活（U/g 質量）=321.54×ΔA÷W×8（稀釋倍數）= 321.54×0.193÷0.1×8（稀釋倍數）=4964 U/g 質量。
取0.1g綠蘿加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.438-1.386=0.052，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.164-1.16=0.004，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.052-0.004=0.048，按樣本質量計算酶活：FBA酶活（U/g 質量）=321.54×ΔA÷W= 321.54×0.048÷0.1=154.3392 U/g 質量。
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