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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5750-50T/48S
更新時間：2024-04-23
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1270
010-50973130
產品分類
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細胞銅（Cu）含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5750
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑一：若有試劑析出，置于37℃水浴溶解即可。
2. 標準品：10mmol/L（即10000nmol/mL）硫酸銅標準液。
3. 20nmol/mL標準品配制：將10000nmol/mL標準液用蒸餾水先稀釋為200nmol/mL的標準溶液，再將200nmol/mL標準液稀釋為20nmol/mL的標準液備用，具體稀釋可參考以下：取20µL 10000nmol/mL的標準液加入980µL蒸餾水混勻，即為200nmol/mL的標準品；再吸取100µL 200nmol/mL的標準液加入900µL蒸餾水混勻，即為20nmol/mL的標準品。
產品說明：
銅（Cu）是人體必需的微量元素之一，也是蛋白質以及酶的重要組成部分。可以存在于紅細胞的內外，主要功能是輔助造血，即催化血紅蛋白的合成。銅元素可以適當促進人體的骨骼發育，促進人體神經系統以及腦部發育，維持嬰幼兒的正常生長發育，因此，測定組織內銅離子含量可知體內是否缺銅。
酸性條件下，Cu2+從銅藍蛋白和清蛋白中解離出來，與絡合劑3,5-二溴-PAESA反應，產生紫色絡合物，在580nm處有特征吸收峰，在一定范圍內吸光度與濃度成正比，從而計算出Cu2+濃度。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
細胞的處理：收集細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細胞數量（106個）：蒸餾水體積（mL）為5~10：0.4的比例（建議5百萬細胞加入0.4mL蒸餾水），超聲波破碎細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔7s，共3min），然后10000g，4℃，離心10min，取上清置冰上待測。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至580nm，蒸餾水調零。
2、 實驗前根據樣本量取部分試劑一37℃預熱10min。
3、 操作表：（在1.5mLEP管中依次加入以下試劑）
試劑名稱（μL） | 空白管 | 測定管 | 標準管 |
蒸餾水 | 250 | - | - |
樣本 | - | 250 | - |
標準品 | - | - | 250 |
試劑一 | 550 | 550 | 550 |
試劑二 | 250 | 250 | 250 |
充分混勻，37℃孵育5min，取反應液于1mL玻璃比色皿中，立即測定580nm處吸光值A，記為A空白、A測定、A標準，計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。空白管和標準管只需測1-2次。 | |||
三、細胞銅（Cu）含量的計算
1. 按細胞數量計算
細胞銅（Cu）含量（nmol/106 cell）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷N =8×ΔA測定÷ΔA標準÷N
2. 按蛋白濃度計算：
細胞銅（Cu）含量（nmol/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷（Cpr×V提取）
= 20×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
C標準：標準品濃度，20nmol/mL；V提取：試劑一體積，0.4mL；N：細胞總數，以百萬計；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。
注意事項：
1. 37℃孵育5min后請立即測定吸光度，若樣本數量過多，可分批次測定，盡量確保在20min內完成測定。
2. 如果樣本測定吸光值大于0.5，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進行測定，注意同步修改計算公式。
3. 如果樣本測定吸光值小于0.005或接近空白管吸光值，可適當增大樣本量，空白管和標準管也需要進行相應調整。
實驗實例：
1. 收集約5百萬SHSY5Y細胞，加入0.4mL蒸餾水，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔7s，共3min），10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.187-0.071=0.116，ΔA標準=A標準-A空白=0.441-0.071=0.370，按細胞數量計算銅含量得：
細胞銅含量（nmol/106 cell）= 8×ΔA測定÷ΔA標準÷N=0.5016 nmol/106 cell。
2. 收集約5百萬U937細胞，加入0.4mL蒸餾水，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔7s，共3min），10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.129-0.071=0.058，ΔA標準=A標準-A空白=0.441-0.071=0.370，按細胞數量計算銅含量得：
細胞銅含量（nmol/106 cell）= 8×ΔA測定÷ΔA標準÷N=0.2508 nmol/106 cell。
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