細胞銅（Cu）含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5755

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：若有試劑析出，置于37℃水浴溶解即可。

2. 標準品：10mmol/L（即10000nmol/mL）硫酸銅標準液。

3. 20nmol/mL標準品配制：將10000nmol/mL標準液用蒸餾水先稀釋為200nmol/mL的標準溶液，再將200nmol/mL標準液稀釋為20nmol/mL的標準液備用，具體稀釋可參考以下：取20µL 10000nmol/mL的標準液加入980µL蒸餾水混勻，即為200nmol/mL的標準品；再吸取100µL 200nmol/mL的標準液加入900µL蒸餾水混勻，即為20nmol/mL的標準品。

產品說明：

銅（Cu）是人體必需的微量元素之一，也是蛋白質以及酶的重要組成部分。可以存在于紅細胞的內外，主要功能是輔助造血，即催化血紅蛋白的合成。銅元素可以適當促進人體的骨骼發育，促進人體神經系統以及腦部發育，維持嬰幼兒的正常生長發育，因此，測定細胞內銅離子含量可知體內是否缺銅。

在酸性條件下，Cu²⁺從銅藍蛋白和清蛋白中解離出來，與絡合劑3,5-二溴-PAESA反應，產生紫色絡合物，在580nm處有特征吸收峰，在一定范圍內吸光度與濃度成正比，從而計算出Cu²⁺濃度。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

細胞的處理：收集細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細胞數量（10⁶個）：蒸餾水體積（mL）為5~10：0.4的比例（建議5百萬細胞加入0.4mL蒸餾水），超聲波破碎細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔7s，共3min），然后10000g，4℃，離心10min，取上清置冰上待測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至580nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 實驗前根據樣本量取部分試劑一37℃預熱10min。

3、 操作表：（在1.5mLEP管或96孔板中加入下列試劑）

三、細胞銅（Cu）含量的計算

按細胞數量計算

細胞銅（Cu）含量（nmol/10⁶ cell）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷N =8×ΔA測定÷ΔA標準÷N

按蛋白濃度計算：

細胞銅（Cu）含量（nmol/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷（Cpr×V提取）

= 20×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

C標準：標準品濃度，20nmol/mL；V提取：試劑一體積，0.4mL；N：細胞總數，以百萬計；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。

注意事項：

1. 37℃孵育5min后請立即測定吸光度，若樣本數量過多，可分批次測定，盡量確保在20min內完成測定。

2. 如果樣本測定吸光值大于0.5，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進行測定，注意同步修改計算公式。

3. 如果樣本測定吸光值小于0.005或接近空白管吸光值，可適當增大樣本量，空白管和標準管也需要進行相應調整。

實驗實例：

1. 收集約5百萬SHSY5Y細胞，加入0.4mL蒸餾水，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔7s，共3min），10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.152-0.092=0.060，ΔA標準=A標準-A空白=0.334-0.092=0.242，按細胞數量計算銅含量得：

細胞銅含量（nmol/10⁶ cell）=8×ΔA測定÷ΔA標準÷N =0.3967 nmol/10⁶ cell。

2. 收集約5百萬U937細胞，加入0.4mL蒸餾水，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔7s，共3min），10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.122-0.092=0.030，ΔA標準=A標準-A空白=0.334-0.092=0.242，按細胞數量計算銅含量得：

細胞銅含量（nmol/10⁶ cell）=8×ΔA測定÷ΔA標準÷N =0.1983 nmol/10⁶ cell。

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