植物根系活力檢測試劑盒（TTC法）說明書

微量法

貨號：BC5275

規格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一支試劑一B加入一瓶試劑一A中，加入30mL試劑二溶解。現用現配。配制好后置于2-8℃，一周內使用，若出現紅色，則不能使用。

2、 試劑二：若試劑有結晶析出，可40℃加熱或者超聲溶解。

3、 試劑四：乙酸乙酯，自備。提供一125mL 空瓶。

4、 標準品：臨用前加入1mL試劑二，充分震蕩混勻, 即10mg/mL TTC標準液。2-8℃可以保存1周，若出現紅色，則不能使用。

產品說明：

根系是植物吸收水分和礦質營養的主要器官，同時又是植物體中重要物質如氨基酸、激素等物質合成、同化、轉化的器官，因此根的生長情況和活動能力直接影響植物個體的生長情況、營養水平和產量水平等，根系活力具有重要的實際意義。

TTC可被氫還原成不溶性的紅色三苯基甲臜（TTF），TTF在485nm處有吸收峰。當TTC溶液滲入到植物根部組織時，呼吸過程產生的還原物質可將其還原成TTF(紅色)，植物根部組織被染成紅色。根系活力強弱可用TTC的還原量來表示。此方法檢測的根系活力即植物根系的脫氫酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板(非聚苯乙烯材質)、研缽/勻漿器、乙酸乙酯，冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

樣本的制備：將根部組織洗凈，去除根上的泥土，輕輕擦干，不要過分擠壓破壞根系細胞。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至485nm，可見分光光度計用乙酸乙酯調零。

2、 標準溶液的稀釋：

（1） 臨用前取10μL 10mg/mL TTC標準液，加入1990μL試劑二，充分混勻，配制成50μg/mL TTC標準溶液，現用現配。（后續實驗需要1000μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

（2） 取1mL 50 μg/mL TTC標準溶液加入到一支試劑三內，充分震蕩混勻2min。混勻后加入1mL乙酸乙酯，再次充分震蕩混勻2min，室溫靜置分層5min，取上層溶液。

（3） 將上層溶液用乙酸乙酯進行稀釋，得到20μg/mL標準溶液備用（吸取200μL 50 μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混勻即可）。

3、標準溶液的測定

取200μL 20μg/mL標準溶液和200μL乙酸乙酯（即0μg/mL）于微量玻璃比色皿或96孔板(非聚苯乙烯材質)中，分別測定其在485nm處的吸光度。計算ΔA標準= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}。ΔA標準只需做1-2次。

4、在2mL EP管按下表步驟加樣：

充分研磨（建議在通風櫥操作）后全部移至于離心管中，12000 rpm，4℃，離心 10min，取 200μL 上清至微量玻璃比色皿或96孔板(非聚苯乙烯材質)中，測定 485nm下的吸光值。計算ΔA測定=A測定-A對照（標準曲線只需做1-2次，每一個測定管對應一個對照管）。ΔA測定的測定范圍在0.005-1.5之間。

三、根系活力計算

按照樣本質量計算根系活力：以TTC的還原量來表示根系活力

TTC還原強度 [ μg TTC/(g·h) ] =ΔA測定×C標÷ΔA標準×V÷ (W×T)=5×ΔA測定÷ΔA標準÷W

W：根重，g；C標：標準溶液濃度，20μg/mL；T：反應時間，4h；V：試劑四的體積即勻漿體積，1mL。

注意事項：

1、 試劑四容易揮發，有毒，為了您的健康，請穿實驗服，戴口罩，戴乳膠手套操作。

2、 若樣品37℃暗反應未到4h但根系已出現深粉色，此時可以直接進行下一步實驗操作；若ΔA測定大于1.5，可以減少樣本質量或者縮短反應時間進行實驗，計算公式注意修改。

3、 若4h暗反應結束后，根系沒有出現粉色或者ΔA測定小于0.005，可以延長暗反應時間（8h，16h甚至24h）或者加大樣品量，計算公式注意修改。

4、 如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉速或者延長時間，例如15000rpm 4℃離心20min。

實驗實例：

1、 稱取0.131g蔥的根部，洗凈，擦干，按照測定步驟操作，用96孔板（非聚苯乙烯材質）測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.714-0.082=0.632，ΔA標準= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，帶入公式計算：

TTC還原強度=5×ΔA測定÷ΔA標準÷W =39.033 μg TTC/(g·h)

2、 稱取0.126g景天的根部，洗凈，擦干，按照測定步驟操作，用96孔板（非聚苯乙烯材質）測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.422-0.139=0.283，ΔA標準= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，帶入公式計算：

TTC還原強度=5×ΔA測定÷ΔA標準÷W =18.172 μg TTC/(g·h)

3、 稱取0.118g蒜的根部，洗凈，擦干，按照測定步驟操作，用96孔板（非聚苯乙烯材質）測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.191-0.055=0.136，ΔA標準= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，帶入公式計算：

TTC還原強度=5×ΔA測定÷ΔA標準÷W =9.325 μg TTC/(g·h)

參考文獻：

[1] Xiuyun Zhu, Meng Liang,Yu Ma. A Review Report on the Experiments for the Determination of Root Activity by TTC Method[J]. Guangdong Chemical Industry, 2020

[1] Sangen Wang. Plant Physiology Experiment Course[M]. Science Press, 2005.

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