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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4950-50T/24S
更新時間：2024-04-17
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：829
010-50973130
產品分類
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海藻糖合成酶（TS）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4950
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體7mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 2-8℃保存 | |
試劑四 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用取一瓶前先加入7 mL蒸餾水，震蕩使其充分溶解（若溶解后的試劑中有黑色顆粒物，可離心后取上清使用），用不完的試劑2-8℃保存2周。
2、 工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四1:1等體積混合，根據樣本實際所需用量現配現用。
3、 標準品：臨用前加入1 mL蒸餾水配制成50 μmol/mL的麥芽糖標準溶液，用不完的試劑2-8℃保存2周。然后用蒸餾水16倍稀釋成3.125 μmol/mL的麥芽糖標準溶液（建議吸取25μL 50μmol/mL麥芽糖標準溶液，加入375μL蒸餾水中，充分混勻）待測，現用現配。
產品說明：
海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩定性、抗凍結性等特性，是細胞在不良環境條件下產生的一種重要的抗逆應激物之一，它對生物大分子和生物組織有著非特異性的保護作用。
海藻糖合成酶（Trehalose Synthase，TS）能催化麥芽糖生成海藻糖，是海藻糖生物合成的關鍵途徑之一。本試劑盒使用糖化酶分解剩余麥芽糖為葡萄糖，通過葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，按照麥芽糖減少的量表示海藻糖合成酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、低溫離心機、恒溫水浴鍋、可調式移液槍、研缽/勻漿器、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細胞（功率200W，超聲3s，間隔9s，重復30次）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復上述離心步驟），置于冰上待檢。
組織：按照組織質量（g）: 提取液體積（mL）為1 : 5~10 的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液），進行冰浴勻漿。8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復上述離心步驟，置于冰上待檢。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30 min以上，調節波長至505 nm，蒸餾水調零。
2、 在EP管中進行如下操作：
（1）酶促反應
加入試劑（μL） | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 100 | 100 | - | - |
試劑一 | - | 100 | - | - |
標準溶液 | - | - | 100 | - |
蒸餾水 | - | - | 100 | 200 |
充分混勻，35℃水浴反應2 h，沸水浴5 min終止反應，冷卻至室溫。 | - | - | ||
試劑一 | 100 | - | - | - |
試劑二 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻，40℃過夜反應（12 h以上），沸水浴5 min終止反應，冷卻至室溫。10000 g ，25℃離心10 min，取上清待測。 | ||||
（2）顯色反應（在EP管中進行以下操作）
加入試劑（μL） | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
上清液 | 100 | 100 | 100 | 100 |
工作液 | 900 | 900 | 900 | 900 |
充分混勻，37℃反應30 min，于1 mL玻璃比色皿中測定505 nm處的吸光值，分別記為A對照、A測定、A標準與A空白，ΔA測定=A對照-A測定、ΔA標準=A標準-A空白。 | ||||
注：空白管和標準管只需測1~2次。
三、酶活性計算
1、按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。
TS酶活（U/mg prot）= C標×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F÷2
=13.02×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr×F
2、按樣本質量計算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。
TS酶活（U/g 質量）= C標×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（V樣÷V樣總×W）÷T×F÷2
=13.02×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F
3、按細菌或細胞數量計算：
單位的定義：每104個細菌或細胞每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。
TS酶活（U/104 cell）= C標×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（V樣÷V樣總×cell）÷T×F÷2
=13.02×ΔA測定÷ΔA標準÷cell×F
C標：標準管濃度，3.125 μmol/mL=3.125×103 nmol/mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；T：反應時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；cell：細胞或細菌總數，以萬計；F：稀釋倍數； 2：1分子麥芽糖可轉化為2分子葡萄糖。
注意事項：
1、 當吸光值大于1.5或者ΔA測定大于1時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后測量。計算公式注意乘以稀釋倍數。
實驗實例：
1、 取0.1 g小鼠肝臟加入1 mL提取液進行勻漿研磨，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用1 mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A對照-A測定=1.471-0.817=0.654、ΔA標準=A標準-A空白=0.790-0.003=0.787，按樣本質量計算酶活得：
TS酶活（U/g 質量）= 13.02×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =216.393 U/g 質量。
2、 取0.1 g海帶加入1 mL提取液進行勻漿研磨，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用1 mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A對照-A測定=1.059-0.629=0.430、ΔA標準=A標準-A空白=0.790-0.003=0.787，按樣本質量計算酶活得：
TS酶活（U/g 質量）=13.02×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =142.277 U/g 質量。
相關系列產品：
BC0330/BC0335 海藻糖含量檢測試劑盒
BC2510/BC2515 海藻糖酶（THL）活性檢測試劑盒
海藻糖合成酶（TS）活性檢測試劑盒 糖代謝 海藻糖合成酶（TS）活性檢測試劑盒 糖代謝
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