乙酰乙酸（AcAc）含量檢測試劑盒（WST法）說明書

                                          微量法

貨號：BC5075

規格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支加入600μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復凍融。

2、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存2周。避免反復凍融。（試劑三由于不便保存，故多給一支）

3、 標準品：8mg 乙酰乙酸鋰。臨用前加入950μL蒸餾水，充分溶解，即8mg/mL 乙酰乙酸鋰標準溶液。-20℃分裝保存4周。

4、 工作液配制：臨用前根據試驗所需量將試劑一、試劑二、試劑三按照170:8:2（180μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略），現用現配，工作液在4h內用完。

產品說明：

乙酰乙酸(AcAc)是酮體的重要成分之一，約占正常人酮體總量20%，是脂肪酸通過氧化產生的,是一種較強的有機酸。正常含量的乙酰乙酸對人體無害，糖尿病患者由于糖的利用降低，或饑餓時由于糖的代謝障礙，大量動用脂肪，乙酰乙酸的量都會積累。乙酰乙酸即可轉化成丙酮，也可以轉化成β-羥丁酸。

在檢測中，乙酰乙酸通過偶聯酶反應產生450nm吸收峰的產物，與存在的乙酰乙酸成比例。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、超聲波細胞破碎儀、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織樣本的制備：按照質量（g）: 提取液體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；12000 g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等其它液體樣本：直接測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至450 nm，蒸餾水調零。

2、 標準溶液配制：將80mg/mL 乙酰乙酸鋰標準溶液，用蒸餾水稀釋至0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 mg/mL標準溶液待用。

3、 按下表步驟加樣：

三、AcAc含量計算

1、 標準曲線繪制：以乙酰乙酸鋰標準溶液濃度為橫坐標（x，mg/mL），以ΔA標準為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程求得x（mg/mL）。

2、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

AcAc含量（μmol/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷108.02×1000÷108.02=9.258x÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

AcAc含量（μmol/g 質量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×1000÷108.02=9.258x÷W

（3）按照細胞或細菌數量計算

AcAc含量（μmol/10⁴ cell）=x×V樣÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷108.02×1000=9.258x÷細胞數量

（4）按照血清（漿）體積計算

AcAc含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣÷108.02=9.258x

V樣：反應中加入樣本體積，20 μL=0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；細胞數量：細胞或細菌總數，以10⁴計；V樣總：加入提取液體積，1 mL；108.02：乙酰乙酸鋰分子量，mg/mmol。

注意事項：

1、顯色完成后，請在15min之內完成檢測。

2、如果測定吸光值低于或超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

實驗實例：

1. 取20 μL 牛血清按上述步驟進行實驗，用96孔板測定后進行計算ΔA測定=A空白-（A測定-A對照）=0.802-（0.837-0.076）=0.041，帶入標準曲線y=0.2259x+0.0145，計算x=0.117。計算

AcAc含量（μmol/mL）=9.258x=1.082μmol/mL

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