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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC1540-50T/24S
更新時間：2024-07-09
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1256
010-50973130
產品分類
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亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1540
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體8mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解，2-8℃保存2周；
2、 試劑三：臨用前加入15mL蒸餾水，可70-80℃加熱溶解；2-8℃保存3個月。
3、 試劑五：若出現沉淀，可70-80℃加熱溶解；
4、 標準品：10µmol/mL亞硝 *標準溶液；
5、 工作液：臨用前根據樣本量將試劑四和試劑五按1:1的比例混合，現用現配。
產品說明：
亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）是亞硝態氮還原過程中的關鍵酶，在自然界氮素循環過程中發揮著重要作用，其廣泛存在于微生物及植物體內，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態氮在環境中的積累，降低其對生物體生長發育的毒害作用。
亞硝酸還原酶可將NO2-還原為NO，使樣本中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2-減少，即540nm處吸光值的變化可反應樣本中亞硝酸還原酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、天平、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按樣本質量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后，于4 ℃，10000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
2. 細菌或細胞：按細胞數量（104）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例（建議500萬細胞加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴超聲破碎細胞（功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，10000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min 以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。
2、 標準液的稀釋：將10µmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋至0.08、0.06、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.0015625µmol/mL標準溶液待測。
3、 標準液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（µmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（µmol/mL） |
1 | 10 | 30 | 270 | 1 |
2 | 1 | 80 | 920 | 0.08 |
3 | 1 | 60 | 940 | 0.06 |
4 | 1 | 50 | 950 | 0.05 |
5 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
6 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
7 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
8 | 0.00625 | 500 | 500 | 0.003125 |
9 | 0.003125 | 500 | 500 | 0.0015625 |
備注：實驗中每個標準管需350µL標準溶液。
4、 樣本測定：
試劑名稱（μL） | 基質管 | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | - | 100 | 100 | - | - |
蒸餾水 | 100 | 200 | - | - | - |
試劑一 | 200 | - | 200 | - | - |
試劑二 | 200 | 200 | 200 | - | - |
混勻后，25℃反應1h | - | - | |||
試劑三 | 200 | 200 | 200 | - | - |
充分震蕩30s，靜置5min，取上清 | - | - | |||
上清液 | 350 | 350 | 350 | - | - |
標準品 | - | - | - | 350 | - |
蒸餾水 | - | - | - | - | 350 |
工作液 | 700 | 700 | 700 | 700 | 700 |
充分混勻，靜置5min，于1mL玻璃比色皿中測定540nm各管吸光值，分別記為A基質管、A對照管、A測定管、A標準管和A空白管，計算ΔA測定=A基質管-（A測定管-A對照管），ΔA標準=A標準管-空白管。標準曲線、空白管和基質管只需測1-2次，每個測定管需設一個對照管。 | |||||
三、亞硝酸還原酶活性計算
1. 標準曲線的繪制
以標準溶液濃度為x軸（x，μmol/mL），標準溶液對應的ΔA標準為y軸（y，ΔA標準），建立標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程得到x（μmol/mL）。
2. 酶活計算
（1）按照蛋白濃度計算
酶活單位定義：每mg組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2÷Cpr÷T=x×7÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活單位定義：每g組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（U/g 質量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W
（3）按照細菌/細胞數量計算
酶活單位定義：每104個細菌/細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（U/104 質量）=x×V1÷V2×V提÷細菌/細胞數量÷T=x×7÷細菌/細胞數量
V1：取上清液前的反應體系體積，0.7mL；V2：加入的樣本體積，0.1mL；V提：加入的提取液體積，1.0mL；T：反應時間，1h；W：土樣質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細菌/細胞數量：以104計。
實驗實例：
1、 取0.1g鳶尾葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A基質管-（A測定管-A對照管）=0.678-（0.322-0.007）=0.363，帶入標準曲線y=8.633x+0.0038，計算x=0.0416，按樣本質量計算含量得，按樣本質量計算酶活得：
NiR（U/g 質量）=x×7÷W=0.0416×7÷0.1=2.913 U/g 質量。
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